Mark Donohue commence sa carrière automobile en 1962 dans des courses de voitures de sport, avec l'aide de Walt Hansgen. Ses premiers résultats significatifs sont obtenus en 1966, avec une troisième place à Daytona et une deuxième place lors des 12 Heures de Sebring, au volant d'une Ford GT40. La même année, il est engagé par Roger Penske pour disputer le championnat Can-Am et quelques courses en USRRC au volant d'une Lola T70. Il remporte sa première victoire sur le circuit Pacific Raceways en USRRC, puis une deuxième sur le circuit canadien de Mosport Park en Can-Am.

En 1967, il ne remporte aucune victoire en Can-Am, mais il s'impose à six reprises en USRRC et remporte le titre. Il remporte également trois victoires en Trans-Am avec une Chevrolet Camaro. En 1968, il remporte à nouveau le championnat USRRC avec quatre victoires, se classe troisième en Can-Am avec une victoire et remporte neuf victoires en Trans-Am.

Il commence sa saison 1969 en remportant les 24 Heures de Daytona avec une Lola T70, puis ajoute six victoires à son palmarès en Trans-Am et commence à courir en USAC. En 1970, il se classe deuxième des 500 Miles d'Indianapolis.

En 1971, il remporte ses deux premières victoires en USAC, à Pocono et à Brooklyn. Cette même année, il dispute sa première course de Formule 1 et réalise une belle performance dès sa première course, se qualifiant en huitième position et terminant troisième de la manche canadienne au volant d'une McLaren M19A engagée par Penske. En Trans-Am, c'est de nouveau un récital, puisqu'il remporte sept victoires au volant d'une AMC Javelin. S'il y avait eu un championnat des pilotes en Trans-Am, il en aurait remporté trois !

L'année suivante, il participe au championnat USAC avec une McLaren et remporte l'épreuve la plus prestigieuse des États-Unis : les 500 Miles d'Indianapolis. Il court également en Can-Am et remporte une victoire au Klondike, avant d'être victime d'un grave accident lors d'essais privés. A plus de 240 km/h, la partie arrière de la carrosserie de sa Porsche se détache, puis la voiture décolle et fait plusieurs tonneaux. L'avant de la voiture a été arraché, laissant Mark, attaché à son siège, les jambes pendantes à l'extérieur. Étonnamment, il n'a souffert que d'une luxation du genou !

Complètement remis, il ne rate pas la saison 1973 de Can-Am. Sur les huit épreuves de la saison, il remporte la victoire dans les six dernières courses et s'octroie le titre sans difficulté.

Il annonce alors sa retraite, mais revient à la compétition à la fin de l'année 1974, lorsque Roger Penske lui propose de piloter sa monoplace de Formule 1, la PC1. Il ne participe qu'aux deux dernières épreuves. Au Canada, il se qualifie en fond de grille (24e) et termine douzième. Mieux qualifié aux Etats-Unis (14e), il doit abandonner à la suite d'un problème de suspension.

Mark participe à la saison entière de F1 en 1975. Lors des essais qualificatifs, il ne réalise pas de bonnes performances et se qualifie au mieux à la 15e place. En course, il réalise toutefois de belles remontées et termine notamment septième en Argentine, huitième en Afrique du Sud, puis cinquième en Suède, marquant ainsi deux points. Vers la fin de la saison, Penske décide de le faire courir sur une March 751. Dès sa première course, à Silverstone, il est victime, comme de nombreux pilotes, d'un accident à cause de la pluie, mais l'arrêt prématuré de la course lui permet de terminer à la cinquième place.

Lors du warm-up du Grand Prix d'Autriche, un pneu éclate alors qu'il aborde la très rapide courbe de Voëst-Hugel. A plus de 200 km/h, la voiture heurte le rail, s'envole et vient s'écraser dans un fossé en contrebas, tuant un commissaire de piste au passage. Mark est extrait de sa voiture, conscient, mais avec de multiples contusions. Souffrant d'un fort mal de tête, il se rend à l'hôpital de Graz le lendemain. Il tombe dans le coma à la suite d'une hémorragie cérébrale et décède le 19 août. Il avait 38 ans.