DE3050725C2

DE3050725C2 -

Info

Publication number: DE3050725C2
Application number: DE3050725A
Authority: DE
Inventors: David V. Goeddel; Herbert L. Burlingame Calif. Us Heyneker
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-06-24
Publication date: 1988-03-10
Also published as: FR2460330A1; PH19814A; DE3050722C2; FR2518572A1; AU533697B2; IE801214L; GB2121047B; DE3023627A1; JP2622479B2; CA1164375A; US4601980A; CS270884A2; NO167673B; CA1202256A; NO810608L; AU2583484A; DD157343A5; DK172132B1; EP0022242B1; FI802030A7

Description

Genetische Expression

Die DNA (Desoxyribonucleinsäure), aus der Gene bestehen, enthält sowohl Protein codierende oder "Struktur"-Gene als auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information dadurch vermitteln, daß sie Bereiche für die RNA-Polymerase-Bindung, Information für ribosomale Bindestellen usw. bereitstellen. Codiertes Protein wird von der korrespondierenden DNA innerhalb eines Organismus durch einen vielstufigen Prozeß exprimiert, wobei:

1. das Enzym RNA-Polymerase in der Kontrollregion (im folgenden "Promoter" genannt) aktiviert wird und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Boten- (Messenger)-Ribonucleinsäure (mRNA) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren "Stop"-Codons beendet wird:
2. die mRNA-Botschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem "Start"-Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird).

In Übereinstimmung mit dem genetischen Code, spezifiziert die DNA jede Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon" von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im folgenden A, T, C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-("Duplex")-DNA auf, dessen bleibender oder "komplementärer" Strang aus Nucleotiden ("Basen") gebildet wird, die mit den ihnen komplementären Basen im codierenden Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist komplementär zu T und C komplementär zu G. Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert in Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) und 3 (1977), John Wiley und Sons, N.Y.

Schneiden und Verbinden von DNA

Es stehen eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination zur Verfügung, nach denen aneinander angrenzende Enden separater DNA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden geschieht durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch die Wirkung eines Enzyms, einer T4 DNA-Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die jeweiligen Enden in die Position für die anschließende Verbindung gebracht werden. Solche Einzelstränge, als cohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang eines stumpfen Endes mit einem Enzym wie λ-Exonuclease abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restriktionsendonucleasen (im folgenden "Restriktionsenzyme"), die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen Nucleotidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkennungsstelle"), schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erkennungsstellen bekannt. Siehe z. B. R. J. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Viele davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangsequenzen an den Enden eines an sich doppelsträngigen Fragments entstehen. Als komplementäre Sequenzen können die überstehenden oder "cohäsiven" Enden durch Basenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül. Durch die Verwendung von Ligase, das die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste kovalente Bindung. Restriktionsenzyme, die an geschnittener doppelsträngiger DNA "stumpfe"Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch beispielsweise T4-Ligase.

Clonierende Vektoren und rekombinante DNA

Für den vorliegenden Zweck wird folgendes "clonierender Vektor" genannt: ein nichtchromsomales Stück einer doppelsträngigen DNA, das ein intaktes Replikon enthält, so daß der Vektor repliziert werden kann, wenn er in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") durch Transformation gebracht wird. Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird "Transformante" genannt. Derzeit sind die clonierenden Vektoren, die üblicherweise verwendet werden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DNA, genannt "Plasmide".

Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von "rekombinanten" clonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das exogene DNA enthält, bestehen. In besonderen Beispielen kann die Rekombinante "heterologe" DNA einschließen, wobei damit eine DNA gemeint ist, die für Polypeptide codiert, die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt werden, welcher empfindlich ist für die Transformation durch den rekombinanten Vektor. Es werden somit Plasmide mit Restriktionsenzymen geschnitten, um lineare DNA zur Verfügung zu stellen, die verbindbare Enden hat. Diese werden an ein exogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon und eine phänotypische Eigenschaft aufweist, die benützt werden kann, um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird durch Transformation in einen Mikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist, große Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für welches das Gen codiert. Über die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, N.Y. (1977).

Expression von rekombinanter DNA

Neben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluß des lac-Promoters in einem E. coli Bakterium exprimiert (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)). Kürzlich gelang auf die gleiche Weise die Expression der A- und B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das Hormon bilden (D. V. Goeddel et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979)). In jedem Fall wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert. In jedem Fall würden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d. h. als Tandem mit einem anderen Protein, das das gewünschte Produkt durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden Patentschriften beschrieben: GB 20 07 675 A; GB 20 07 670 A; GB 20 07 676 A; GB 20 08 123 A.

Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den Fall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z. B. Wachstumshormonen, Interferon usw., deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu exprimieren, da die Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material erfordert, das innerhalb des Organismus besser für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet werden könnte.

In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse Transkription von korrespondierender Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde. Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens kann die reverse Transkriptase die Transkription von der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cDNA für die komplette, gewünschte Aminosäuresequenz beenden. So haben beispielsweise Villa-Komaroff et al. eine cDNA für Ratten- Proinsulin erhalten, dem die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 75, 3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert werden, eine cDNA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryotischen Zelle Führersequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen) enzymatisch abgetrennt werden. Bisher ist keine Bakterienzelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so daß das mRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben hat, die die Leader-Sequenz der Vorläuferform enthalten, als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff, a.a.O. (Ratten-Proinsulin); P. H. Seeburg et al., Nature 276, 795 (1978) (Rattenwachstumshormon)).

Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offensichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z. B. Villa-Komaroff, a.a.O. (Penicillinase-Proinsulin); Seeburg, a.a.O. (β-Lactamase-Wachstumshormon).

Menschliches Wachstumshormon

Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren und ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 21 500, mehr als dreimal so groß wie Insulin. Bis zur vorliegenden Erfindung konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeitsaufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden - der Hypophyse aus menschlichen Leichen. Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Funktionsstörung der Hypophyse verursachtem hypophysären Zwergenwuchs begrenzt, und sogar hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, daß vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, daß nicht mehr als 50% der Betroffenen damit behandelt werden können.

Zusammengefaßt besteht daher eine Notwendigkeit für neue Methoden, um HGH und andere Polypeptidprodukte in großen Mengen herzustellen. Diese Notwendigkeit ist besonders akut in dem Fall, wenn Polypeptide zu groß sind, um organische Synthese zuzulassen oder, aus diesem Grund, mikrobiologische Expression von vollständigen synthetischen Genen. Die Expression von Säugetierhormonen von mRNA-Transskripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten, die dem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits jedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion von bioinaktiven Konjugaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können.

Die vorliegende Erfindung stellt zur Expression quasi-synthetischer Gene geeignete Plasmide zur Verfügung, wobei durch reverse Transskription ein wesentlicher Bestandteil, vorzugsweise die Mehrheit der codierenden Sequenz zur Verfügung gestellt wird, ohne den arbeitsaufwendigen Umweg der vollständigen synthetischen Konstruktion, während die Synthese des Rests der codierenden Sequenz ein komplettes Gen liefert, das fähig ist zur Expression des gewünschten Polypeptids, ohne die Begleitung von bioinaktivierenden Leader-Sequenzen oder anderem Fremdprotein. Alternativ dazu kann der synthetische Rest ein gegen Proteolyse resistentes Konjugat ergeben, so gebaut, daß das Schneiden des Fremdproteins außerhalb der Zelle ermöglicht ist, wodurch die bioaktive Form erhalten wird. Die Erfindung stellt folglich Plasmide, einsetzbar für die mikrobielle Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch kostenaufwendige Extraktion aus Gewebe hergestellt werden konnten und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet waren.

Die Art, auf welche dieses Ziel und Vorteile der Erfindung erreicht werden können, wird aus der folgenden Spezialbeschreibung verständlich sowie aus den beigefügten Zeichnungen, die sich auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung beziehen. Es zeigt

Fig. 1 das Syntheseschema für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim Clonen verwendet werden. Die Pfeile im codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem komplementären oder unteren Strang ("L") bezeichnen die Oligonucleotide, die miteinander verbunden wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;

Fig. 2 die Verbindungen der "U"- und "L"-Oligonucleotiden, für die Bildung des Genfragments aus Fig. 1, und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendem Vektor;

Fig. 3 die DNA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines HaeIII-Restriktionsenzymfragments eines Hypophysen- mRNA-Transkripts, mit den numerierten Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren. Schlüsselrestriktionserkennungsstellen sind bezeichnet, ebenso DNA (auf "Stop" folgende) für nicht translatierte mRNA;

Fig. 4 die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein Genfragment, das für die Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplementäre DNA durch reverse Transkription von mRNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;

Fig. 5 die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons fähig ist, beginnend mit den Plasmiden der Fig. 2 und 3.

Der generelle Weg der Erfindung ist die Kombination mehrerer Genfragmente in einem einzigen clonierenden Vektor, wobei diese Genfragmente in Kombination für die Expression des gewünschten Produkts codieren. Von den Genfragmenten ist mindestens eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet ist, welche aus Gewebe isoliert wurde, wie durch die Methode nach A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). Die cDNA stellt einen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons für das gewünschte Produkt zur Verfügung, während restliche Teile des Gens synthetisch erhalten werden. Die synthetischen und die mRNA-Transkriptfragmente werden getrennt geclont, um ausreichende Mengen für den Einsatz in dem späteren Kombinationsschritt zur Verfügung zu stellen.

Eine Vielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung der Codons für das Endprodukt, z. B. zwischen synthetischer und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977). Komplementäre DNA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche Weise Codons für mindestens eine Carboxyl-Endgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Translations- Stopsignalen, benachbart zum Carboxylende liegende Codons für nicht translatierte mRNA. Die Anwesenheit von DNA für nicht translatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z. B. durch Schneiden mit Restriktionsenzymen entfernt werden können, um zelluläres Material zu erhalten, das für die Replikation und Expression der DNA für das angestrebte Produkt benötigt wird. In besonderen Fällen wird die cDNA Codons für die vollständige, gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso wie fremde Codons stromaufwärts vom Aminoende des angestrebten Produkts. Zum Beispiel werden viele, wenn nicht alle, Polypeptidhormone in einer Vorläuferform exprimiert mit Leader- oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispielsweise beim Transport zur Zellwand beteiligt ist. Während der Expression von eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt, so daß das Hormon in seiner freien, bioaktiven Form in den periplasmatischen Raum eindringt. Man kann sich jedoch nicht darauf verlassen, daß mikrobielle Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert, Sequenzen, die für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mRNA-Transkript zu entfernen. Im Verlauf dieses Entfernungsvorgangs geht auch das Translations- Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige Codons für das angestrebte Produkt entfernt. Die synthetische Komponente des quasi-synthetischen Genprodukts der Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso stellt sie ein neues Translations-Startsignal zur Verfügung, wobei der Vektor, in dem sich das Hybridgen letztlich entwickeln wird, selbst keinen günstig gelegenen Start aufweist.

Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus Wachstumshormon-cDNA wird begünstigt durch das Zurverfügungstellen einer Restriktionserkennungsstelle innerhalb des das Wachstumshormon codierenden Teils des Gens. Es kann nichtsdestotrotz auch ohne das Zurverfügungstellen einer solchen Erkennungsstelle durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Restriktionserkennungsstelle, die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten Polypeptids liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht von mRNA abgeleitet ist. In jeder cDNA, die für das gewünschte Polypeptid und eine Leader- oder andere bioinaktivierende Sequenz codiert, wird sich daher die Grenze zwischen den Codons der letzteren und denen des reifen Polypeptids an der Aminosäurensequenz des reifen Polypeptids zeigen. Man kann einfach in die Gene verdauen, die für das Peptid der Wahl codieren, und so die ungewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen. Wenn daher beispielsweise eine cDNA folgender Struktur gegeben ist:

etc.

wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet ist, kann eine Reaktionsbedingung für eine Exonuclease- Verdauung gewählt werden, um die oberen Sequenzen "a" und "b" zu entfernen, wonach eine S1-Nuclease-Verdauung automatisch die unteren Sequenzen "c" und "d" eliminiert. Alternativ dazu und präziser kann man DNA- Polymerase-Verdauung in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten ("d(A,T,C,G)TP") einsetzen. Im obengenannten Beispiel wird daher DNA-Polymerase in der Gegenwart von dGTP die Sequenz "c" entfernen (und bei "G" anhalten), daraufhin wird S1-Nuclease "a" verdauen; DNA-Polymerase in Gegenwart von dTTP wird "d" entfernen (und bei "T" anhalten) und S1-Nuclease wird dann "d" herausschneiden usw. Siehe allgemein A. Kornberg, DNA Synthesis, S. 87-88, W. H. Freeman und Co., San Francisco (1974).

Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Restriktionserkennungsstelle an einem passenden Punkt innerhalb des Bereichs der cDNA, die für das gewünschte Produkt codiert, konstruieren, durch Anwendung der "unpassenden" ("mismatch") Reparatursynthesetechnik von A. Razin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 4268 (1978). Bei dieser Technik können eine oder mehrere Basen in eine bestehende DNA-Sequenz substituiert werden, wobei Primer verwendet werden, die den unpassenden Substituenten enthalten. Mindestens sieben palindromartige 4-Basenpaarsequenzen werden selektiv durch bekannte Restriktionsenzyme erkannt, das sind AGCT (AluI), CCGG (HpaII), CGCG (ThaI), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC (HaeIII), und TCGA (TaqI). Wenn die cDNA-Sequenz eine Sequenz enthält, die sich von einer derartigen Erkennungsstelle in nur einer einzigen Base unterscheidet, was statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese eine replizierte cDNA zu erhalten, die die geeignete, substituierte Base enthält und damit die gewünschte Restriktionserkennungsstelle. Durch einen Schnitt wird die DNA vom unerwünschten Leader entfernt, wonach durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptids benötigt werden. Zum Beispiel:

Es ist natürlich offensichtlich, daß längere Restriktionserkennungsstellen auf ähnliche Weise eingesetzt werden können, wo das erwünscht ist, oder daß durch sukzessive Reparatur 4-Basenpaar-Restriktionserkennungsstellen gebildet werden können, wo lediglich 2 Basen gemeinsam mit der Erkennungsstelle am gewünschten Punkt erscheinen usw.

Es werden sich Anwendungsmöglichkeiten zeigen, bei denen es wünschenswert ist, nicht nur die Aminosäuresequenz des angestrebten Produkts, sondern auch eine bestimmte Menge fremdes, aber speziell hergestelltes Protein zu exprimieren. Vier derartige Anwendungen werden durch Beispiele erwähnt werden. Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf welche Immunogenität durch Konjugation zu einem zusätzlichen Protein übertragen wird, so daß eine Vaccine produziert wird. Siehe allgemein GB 20 08 123 A. Es kann jedoch wieder aus Sicherheitsgründen wünschenswert sein, das angestrebte Produkt als eine Konjugate eines anderen, bioinaktiven Proteins zu exprimieren, die so gebaut sind, daß extrazelluläres Schneiden ermöglicht ist, um die aktive Form zu erhalten. Drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange das Signal-Peptid danach geschnitten werden kann. Schließlich kann eine Fremdverbindung verwendet werden, die so gebaut ist, daß ein spezifischer extrazellulärer Schnitt möglich ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen des mikrobiellen Wirts. Zumindest in den letzten drei Anwendungsbereichen kann der synthetische molekulare Adapter, der verwendet wird, um die codierende Sequenz des mRNA-Transkripts zu vervollständigen, zusätzlich Codons eingebaut haben für Aminosäuresequenzen, die spezifisch geschnitten werden, beispielsweise durch enzymatische Wirkung. Beispielsweise schneidet Trypsin oder Chymotrypsin bei Arg-Arg oder Lys-Lys usw. Siehe GB-Patent 20 08 123 A.

Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die Erfindung in ihrem breitesten Bereich die mannigfaltigen Anwendungen erlaubt, von denen alle die folgenden Eigenschaften gemeinsam aufweisen:

- es wird ein mRNA-Transkript verwendet, das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, das jedoch, falls es alleine exprimiert wird, ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würde, entweder kleiner oder größer als das angestrebte Produkt;
- Protein codierende Codons für andere als solche Aminosäuren, die im angestrebten Produkt enthalten sind, werden, falls vorhanden, entfernt;
- organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz codieren; und
- das mRNA-Transkript und das (die) synthetische(n) Fragment(e) werden zusammengefügt und in eine einen Promoter enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes, konjugiertes Protein, oder das angestrebte Produkt konjugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und exprimiert wird.

Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall mit der Aminosäure beginnen, für die das Translations-Startsignal codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin). Man kann erwarten, daß diese Aminosäure intrazellulär entfernt wird, oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden Produkts im wesentlichen unbeeinflußt läßt.

Mit Hilfe der Erfindung kann ein Verfahren allgemeiner Anwendbarkeit bei der Produktion von nützlichen Proteinen, einschließlich Antikörpern, Enzymen und ähnlichem zur Verfügung gestellt werden, im besonderen die Expression von Polypeptidhormonen von Säugetieren und anderen Substanzen mit medizinischer Anwendung, z. B. Glucagon, gastrointestinale Inhibitorpolypeptide, Polypeptide der Bauchspeicheldrüse, Adrenokortikotropin, β-Endorphine, Interferon, Urokinase, Blutgerinnungsfaktoren, menschliches Albumin usw. Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform, die die Erfindung erläutert, beschrieben, bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für menschliches Wachstumshormon codiert, konstruiert, geclont und mikrobiell exprimiert wird.

Konstruktion und Expression eines clonierenden Vektors für menschliches Wachstumshormon 1. Clonieren des Hae-III-Fragments des mRNA-Transkripts (Fig. 3 und 4)

Polyadenylierte mRNA für menschliches Wachstumshormon (HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzierenden Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). 1,5 µg von Doppelstrang-("ds")-cDNA wird präpariert aus 5 µg dieser RNA, im wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al., J. Biol. Chem. 253 2483 (1978), mit der Ausnahme, daß die RNA-Polymerase "Klenow-Fragment", (H. Klenow, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 65, 168 (1970)) für die DNA-Polymerase I in der Zweit-Strangsynthese eingesetzt wurde. Das Restriktionsmuster von HGH ist derartig, daß HaeIII-Restriktionserkennungsstellen in der 3′ nichtcodierenden Region und in der Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und 24 des HGH codieren, vorhanden sind, wie gezeigt in Fig. 3. Eine Behandlung der ds-HGH-cDNA mit HaeIII gibt ein DNA-Fragment von 551 Basenpaaren ("bp"), die für die Aminosäuren 24 bis 91 des HGH codieren. 90 ng der cDNA wird mit HaeIII behandelt, in einem 8%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die Region bei 550 bp eluiert. Man erhält annähernd 1 ng cDNA.

pBR322, hergestellt nach F. Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95-113, wird als clonierender Vektor für die cDNA ausgewählt. pBR322 ist vollständig charakterisiert, (J. G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 (1978)), ist ein mit zahlreichen Kopien replizierendes Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-Resistenz aufweist, die auf den Einschluß der korrespondierenden Gene ("Ap^R" bzw. "Tc^R" in Fig. 4) zurückzuführen sind, wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme PstI, EcoRI und HindIII enthält, wie in der Figur gezeigt.

Die Schneideprodukte von HaeIII und PstI haben stumpfe Enden. Es kann folglich das GC-Anhängeverfahren nach Chang A.C.Y. et al., Nature 275,617 (1978) angewendet werden, um die stumpfendigen Produkte der PstI-Schnitte von pBR322 mit der HaeIII-Verdauung des mRNA-Transkripts zu verbinden, so daß das cDNA-Fragment in die PstI-Erkennungsstelle von pBR322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die HaeIII-Restriktionserkennungsstellen (GG↓CC) auf der cDNA und die PstI-Restriktionserkennungsstellen (CTGCA↓G) an jedem Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden.

Es wird also terminale Desoxynucleotid-Transferase (TdT) verwendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3′-Ende anzufügen, wie bereits früher beschrieben, Chang A.Y.C., a.a.O. Auf ähnliche Weise werden an das 3′-Ende von 60 ng PstI-behandeltem pBR322 etwa 10 dG-Reste angehängt. Das Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDNA mit der dG-ergänzten Vektor-DNA wird in 130 µl von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 100 mM NaCl und 0,25 mM EDTA durchgeführt. Die Mischung wird auf 70°C erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37°C abgekühlt, und schließlich auf 20°C (6 Stunden) abgekühlt, ehe es zum Transformieren von E. coli x1776 verwendet wird. Eine DNA-Sequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasmids in x1776, stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH überein, wie in Fig. 3 gezeigt.

Der Stamm E. coli K-12 x1776 hat den Genotyp F^-tonA53, dapD8, minA1, supE42, Δ 40 (gal-uvrB), λ ^-, minB2, rfb-2, nalA25, oms-2, thyA57*, metC65, oms-1, Δ 29 (bioH-asd), cycB2, cycA1, hsdR2. x1776 wurde vom National Institutes of Health als ein EK2 Wirts-Vektor-System bescheinigt.

x1776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure (DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolansäure synthetisieren. Die Zelle unterliegt daher dem DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP begrenzt ist, jedoch genügend Nährsubstrat vorhanden ist, um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der Stamm ist Thymin- oder Thymidin-bedürftig und unterliegt dem Thymin-Mangeltod mit Abbau der DNA, wenn Thymin und Thymidin in der Umgebung fehlen, jedoch genügend Nährsubstrate vorhanden sind, um die Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten. x1776 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, d. h. unfähig, eine Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten zu überleben. x1776 ist hochgradig empfindlich gegen Detergentien, Antibiotika, Arzneimittel und Chemikalien. x1776 kann weder die Dunkelreparatur noch die Photo-Reaktivierung von UV-induzierten Schäden durchführen und ist daher um mehrere Größenordnungen empfindlicher gegen Sonnenlicht als der Wildtypstamm von E. coli. x1776 ist resistent gegen viele transduzierende Phagen und läßt bei der Konjugation nur mangelhaft die genetische Übertragung von vielen verschiedenen Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasmiden zu, was auf die Anwesenheit von verschiedenen Mutationen zurückzuführen ist. x1776 ist resistent gegen Nalidixinsäure, Cycloserin und Trimethoprim. Diese Substanzen können daher dem Medium zugegeben werden, um das Überprüfen des Stamms zu ermöglichen und eine Transformation von Kontaminanten während der Transformation auszuschließen.

x1776 wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min. sowohl in L-Nährmedium als auch Penassay-Medium, wenn dieses mit 100 µg DAP/ml und 4 µg Thymidin/ml supplementiert wird und erreicht eine Enddichte von 8-10 × 10⁸ Zellen/ml in der stationären Phase. Vorsichtiges, kreisförmiges Hin- und Herschütteln für eine Zeitspanne von 1 bis 2 Minuten suspendiert die Zellen vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100%. Zusätzliche Details bezüglich x1776 sind zu finden bei R. Curtis et al., Molecular Cloning of Recombinant DNA, 99-177, Scott und Werner, eds., Academic Press (N.Y. 1977). x1776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection am 3. Juli 1979 unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt.

2. Konstruktion und Clonieren des synthetischen Genfragments (Fig. 1 und 2)

Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH- quasi-synthetischen Gens, daß ein synthetisches Fragment konstruiert wird, das stumpfendige Restriktionsschneidestellen aufweist, die an den Punkten sitzen, an denen an das Fragment das mRNA-Transkript angeknüpft werden soll. Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren des HGH enthält daher, wie in Fig. 1 gezeigt, eine auf die Aminosäure 23 folgende HaeIII-Schneideerkennungsstelle. Das distale Ende des synthetischen Fragments wird mit einem Verbindungselement (im folgenden "Linker") versehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dem Plasmid erhalten wird, in das das mRNA-Transkript und das synthetische Fragment letztlich eingebaut werden sollen.

Wie in Fig. 1 gezeigt, haben die 5′-Enden des doppelsträngigen Fragments einzelsträngige cohäsive Enden für die EcoRI- und HindIII-Restriktionsendonucleasen, um die Plasmid-Konstruktion zu erleichtern. Das Codon für Methionin am linken Ende stellt eine Erkennungsstelle für die Initiation der Translation zur Verfügung. Es werden zwölf verschiedene Oligonucleotide, die in ihrer Größe von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem bewährten Phosphotriester-Verfahren nach Crea, R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Diese Oligonucleotide, U₁ bis U₆ und L₁ bis L₆ sind durch Pfeile bezeichnet.

10 µg Substanz von U₂ einschließlich U₆ und L₂ einschließlich L₆ werden unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase und (γ³²-P)ATP phosphoryliert, und zwar nach dem veröffentlichten Verfahren von Goeddel, D. V. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 106 (1979).

Es werden drei getrennte T4-Ligase-Katalysierte Reaktionen durchgeführt: 10 µg des 5′-OH-Fragments U₁ werden mit phosphoryliertem U₂, L₅ und L₆ vereint; phosphoryliertes U₃, U₄, L₃ und L₄ werden vereint; weiterhin werden 10 µg des 5′-OH-Fragments L₁ mit phosphoryliertem L₂, U₅ und U₆ vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4°C für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300 µl von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4-Ligase verwendet werden. Die drei Verknüpfungsmischungen werden dann vereint, 100 Einheiten T4-Ligase zugegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20°C ablaufen läßt. Die Mischung wird dann mit Äthanol ausgefällt und auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen. Die Bande, die bis zur 84 Basenpaar-Stelle gewandert ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert. pBR322 (1 µg) wird mit EcoRI und HindIII behandelt, das große Fragment durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DNA verknüpft. Diese Mischung wird verwendet, um den Stamm E. coli K-12 294 (end A, thi^-, hsr^-, hsm_k⁺) zu transformieren. Der Stamm 294 wurde am 30. Oktober 1978 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen hinterlegt. Eine Sequenzanalyse nach der Maxam und Gilbert-Technik, a.a.O., bei der EcoRI-HindIII-Insertion von einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte das in Fig. 1 dargestellte.

3. Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression von HGH (Fig. 5)

Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mRNA-Transkript in pHGH31 wird ein zur Replikation fähiges Plasmid konstruiert, das beide Fragmente enthält, wobei das Expressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Fig. 5 gezeigt. Das Expressionsplasmid, das einen lac-Promoter als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermaßen konstruiert. Ein 285 Basenpaare langes EcoRI-Fragment, das zwei 95 Basenpaare lange UV5-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche durch ein 95 Basenpaare langes, heterologes DNA-Fragment abgetrennt wurden, wird aus dem Plasmid pKB268 isoliert, siehe K. Backman et al., Cell. Vol. 13, 65-71 (1978). Das 285 bp-Fragment wird in die EcoRI-Erkennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGH1 isoliert, in dem die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene EcoRI-Erkennungsstelle wird durch teilweise EcoRI-Verdauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI-Enden mit DNA-Polymerase I repariert und das Plasmid durch stumpfendige Verbindung wieder in Ringform gebracht. Das resultierende Plasmid, pGH6, enthält eine einzige EcoRI-Erkennungsstelle, die passend liegt im Hinblick auf das Promoter-System, in das das komplette Gen für HGH eingebaut werden kann.

Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem RNA-Transkript fertigzustellen, werden 10 µg von pHGH3 mit EcoRI- und HaeIII-Restriktionsendonucleasen geschnitten und das 77 Basenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8%igen Polyacrylamid-Gel isoliert.

Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 (5 µg) mit HaeIII geschnitten. Die 551 bp HGH-Sequenz und ein mitgewandertes 540 bp HaeIII-Fragment von pBR322 werden durch Gel-Elektrophorese gereinigt. Eine anschließende Behandlung mit XmaI schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3′-nichtcodierenden Region entfernt werden. Das resultierende 512 bp-Fragment wird von dem 540 bp pBR322-HaeIII-Stück durch Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel getrennt. 0,3 µg des 77 bp EcoRI-HaeIII-Fragments werden mit T4-Ligase in einer 16 µl Reaktion 14 Stunden lang bei 4°C polymerisiert. Die Mischung wird dann für 5 Minuten (5′) auf 70°C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren, anschließend mit EcoRI behandelt (um Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer EcoRI-Erkennungsstellen dimerisiert haben), weiterhin mit SmaI behandelt (um XmaI-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591 bp-Fragment mit einem EcoRI-Ende, das cohäsiv ist, und einem SmaI-Ende, das stumpf ist, erhalten wird. Nach der Reinigung auf einem 6%igen Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses Fragments. Es sollte bemerkt werden, daß das Expressionsplasmid pGH6 keine XmaI-Erkennungsstelle enthält. SmaI erkennt jedoch die gleiche Erkennungsstelle wie XmaI, aber schneidet genau durch die Mitte, so daß stumpfe Enden erhalten werden. Das Sma-geschnittene Ende des Fragments, das von gHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pGH6 gebunden werden.

Das Expressionsplasmid pGH6 kann verwendet werden, um die 591 bp HGH-DNA zu clonieren. Dazu wird das Plasmid, das den lac-UV5-Promoter in Tandemform enthält, sukzessive mit HindIII, Nuclease S1 und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt. 50 ng des resultierenden Vektors, der ein cohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der 591 bp HGH-DNA verbunden. Diese Verbindungsmischung wird verwendet, um E. coli x1776 zu transformieren. Die Kolonien werden durch Wachstum auf Tetracyclin (12,5 µg/ml) selektiert. Es ist bemerkenswert, daß die Insertion des hybriden HGH-Gens in pGH6 den Promoter für die Tetracyclin-Resistenz zerstört, daß jedoch der Tandem-lac-Promoter das Durchlesen der Strukturgene für Tetracyclin-Resistenz erlaubt und auf diese Weise die Selektionscharakteristik erhalten bleibt. Es wurden annähernd 400 Transformanten erhalten. Mit der Grunstein-Hogness-Methode, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975), wurden durch Filterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequenz enthalten. Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben das erwartete Restriktionsmuster, wenn sie mit HaeIII, PvuII und PstI geschnitten wurden. Von einem Clon, pHGH107, wurde die DNA-Sequenz bestimmt.

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschließlich auf den Schutzbereich der Patentansprüche. Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, des angestrebten Polypeptidprodukts oder sonstigem. Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem Arabinose-Operon (phi80 dara) oder dem Colicin-E1-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Promoter. Wirtsorganismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familie der Enterobacteriaceae, z. B. die Stämme Escherichia coli und Salmonella; aus der Familie der Bacillaceae, z. B. Bacillus subtilis; weiterhin Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae. Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien für rekombinante DNA des National Institutes of Health, 43 Fed. Reg. 60, 080 (1978) durchgeführt werden sollen.

Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung im Labormaßstab eignet sich der Stamm E. coli x1776 besonders gut; es könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung im großen Maßstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden. Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung, eher als biologischer, können für die Arbeit im großen Maßstab auch solche Organismen wie E. coli K-12 Stamm 294, a.a.O., und E. coli Stamm RR1, Genotyp: Pro^-Leu^- Thi^-R_B-recA⁺Str^r Lac y^- verwendet werden. E. coli RR1 wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HB101 (H. W. Boyer et al., J. Mol.Bio. (1969) 41 459-472) mit dem Stamm E. coli K-12, Stamm KL16 als Hfr-Donor erhalten. Siehe auch J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Eine Kultur von E. coli RR1 wurde am 30. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der Nummer ATCC 31343 hinterlegt. Auf ähnliche Weise wurde eine Kultur von x1776 am 3. Juli 1979 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt. Am 3. Juli 1979 wurden bei der American Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pGH6 (ATCC 40012); E. coli K12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATCC 31539).

Claims

1. Ein Plasmid für die Expression, das Funktionsgene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält, sowie einen lac-Promoter in Tandem-Struktur, der zwischen den genannten Genen liegt und so orientiert ist, daß er die Expression in Richtung des Gens für Tetracyclinresistenz in Gang setzt, das ferner eine Mehrzahl von Restriktionserkennungsstellen enthält, die stromabwärts vom genannten Promoter-System liegen, die jeweils cohäsive und stumpfe Enden nach dem Schneiden liefern, wodurch richtiges Einfügen von heterologer DNA zwischen den genannten Erkennungsstellen ermöglicht wird, so daß diese unter die Kontrolle des genannten Promoter-Systems gelangt.

2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes Plasmid ist: