CN103614296B - 一种双腔三维灌注生物反应器系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双腔三维灌注生物反应器系统，包括生物反应器，生物反应器中设有三维支架，生物反应器连接有灌注装置，生物反应器包括供普通营养培养液填充的第一容腔，以及供诱导培养因子填充的第二容腔，第一容腔和第二容腔之间设有可供分子量小于诱导培养因子中诱导细胞因子的成分通过的透析膜组件，三维支架位于第二容腔中。本发明通过生物反应器的双腔结构设计可以使得两个容腔内的普通营养培养液和诱导培养因子独立换液，在更换普通营养培养液的同时可以保留诱导培养因子，大大减少诱导细胞因子的用量，提高其有效利用率，降低成本。

Description

一种双腔三维灌注生物反应器系统

技术领域

 本发明属于生物工程设备领域，尤其是涉及细胞在三维支架内生长分化的双腔三维灌注生物反应器系统。

背景技术

目前，在生命科学研究领域及医疗领域中，细胞培养方式有多种，按培养的维度分类基本可归为二维及三维培养方式。二维培养方式中，如玻璃或者塑料的培养瓶、培养皿，需要提供一个平面供细胞附着生长，通过对平面材料的类别和接触面的修饰来提供细胞更好的生长环境，同样通过倒置显微镜及普通显微镜可以很便捷的观察细胞的生长状态。但正常细胞在人体和动物体内都是在三维环境内生长，有些细胞无法粘附任何平面生长，因此在体外为细胞提供一种三维的环境进行培养更符合细胞的正常生理状态，有助于更好的模拟体内的相应生长过程。

三维培养在目前技术领域中有多种形式，如：（1）在二维培养平面的基础上，在平面上方加用一层胶原蛋白基质成分，使细胞在基质的三维环境内生长，也可通过人工材料制作三维支架，结合灌流系统进行培养；（2）通过各种形状的旋桨的摆动和旋转提供动力，使细胞悬浮于培养液体的三维环境内生长，也有通过一些人工材料将单个或者多个细胞微囊化，来为细胞提供附着面和细胞间的接触；（3）通过离心力原理来制造一种无重力的环境，使细胞能三维空间里向各个方向生长。

上述细胞三维培养方式中的通过三维支架结合灌注系统进行培养的方式，如公告号为CN 1288235C的专利文件所公开的《一种旋转灌注式生物反应器系统》，其包括生物反应器，该生物反应器包括底座，底座上设有反应容器，该反应容器中填充有培养液以及固设有三维支架，该反应容器通过灌注系统将培养液注入反应容器中，该反应容器两端通过半透膜进行生物反应器内外的气体交换。该旋转灌注式生物反应器系统，可以很好的改善细胞培养环境，促进细胞在三维支架上的分布更均匀，促进氧气和营养物质向支架内部输送，保持支架内部细胞的活性和功能的发挥，实现反应器内外气体实时交换，保证培养液中氧气和二氧化碳的含量基本稳定，维持生理性PH值，为细胞代谢和功能发挥提供更有利的微环境。上述生物反应器中的培养液为了促进细胞的生长和分化，一般包括普通营养培养液和诱导培养因子，普通营养培养液一般包括基本养分如糖分、氨基酸、微量元素等以维持细胞的生长和增殖，还包括缓冲液以调节适宜的生理PH值，而诱导培养因子则作为细胞生长分化的关键成分发挥作用，但因其较难获得和产量低下而异常昂贵。由于上述生物反应器只具有一个反应容器，则必须将生长培养液和诱导培养因子均混合在同一个反应容器中，一次培养的所需诱导培养因子用量很大；普通营养培养液较为便宜，为满足细胞生长，培养液需要经常性的更换，每次随着普通营养培养液的更换，诱导培养因子也随之流失，如此培养，所花费的成本较高。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种双腔三维灌注生物反应器系统，该双腔三维灌注生物反应器系统通过双腔结构和透析膜组件的设计大大提高诱导培养因子的利用率，降低培养成本，比起现有技术中的三维灌注式培养更经济实惠。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种双腔三维灌注生物反应器系统，包括生物反应器，生物反应器中设有三维支架，生物反应器连接有灌注装置，其特征在于：所述生物反应器包括供普通营养培养液填充的第一容腔，以及供诱导培养因子填充的第二容腔，第一容腔和第二容腔之间设有可供分子量小于诱导培养因子中诱导细胞因子的成分通过的透析膜组件，所述三维支架位于所述第二容腔中。

上述结构中，双腔结构的设计使得普通营养培养液和诱导培养因子被分置于两个腔中，并通过双腔之间的透析膜组件使得细胞生长增殖所需的养分可以在两腔中随时交换，而诱导培养因子中的诱导细胞因子等大分子物质则被隔离在第二容腔中；当更换普通营养培养液时可以保留诱导培养因子，大大减少了诱导细胞因子的用量，提高了其有效利用率，大大降低了培养成本。

作为本发明的进一步设置，所述三维支架中设有微孔或微管道，所述微孔或微管道汇合形成两条进出管道分别为动脉进液管和静脉出液管，所述动脉进液管和静脉出液管分别与所述灌注装置连接形成三维支架的内部液体循环机构。

上述结构中，三维支架可以设有天然或人工的三维微或微管道，并通过该微孔或微管道最终形成一个类似人体血管流通的内部液体循环机构，可以将三维支架充满形成一个饱满的三维结构，使得细胞可以更好地附着于三维支架上，使支架内部各个角落的细胞得到很好的气体和代谢物质交换，在使用器官去细胞化支架及一些具有良好生物相容性的人工支架时，在细胞培养后期可以形成形状合适的组织和器官，并可通过动静脉进出液管直移植到体内对应血管上；上述动脉进液管和静脉出液管是指类似于人体血管中的液体由动脉流进，静脉流出的血液循环的管道设置。

作为本发明的进一步设置，所述内部液体循环机构包括分别与所述动脉进液管以及与所述静脉出液管连接的针头组件，所述针头组件相对与所述动脉进液管或静脉出液管连接的另一端与所述灌注装置连接，所述针头组件包括至少两根针头，分别为第一针头和第二针头，第一针头的尾部通过硅胶头与所述第二针头的头部首尾串联连接。

上述结构中，针头组件通过两根针头连接，两根针头支架的硅胶头具有一定的弹性使得该第一针头与动脉进液管连接的一端具有更好的摆动性，便于安装三维支架及与针头组件的安装；另外该硅胶头的设置可以起到防气泡进入第二容腔的作用，当将该硅胶头充满液体后，两个针头之间连接的密封性良好，而当第二针头与灌注装置的连接断开之后，如果没有硅胶头的设置，空气中的气体会随之进入第二容腔中，严重时，会堵塞三维支架内的管脉系统，影响细胞的培养。

作为本发明的进一步设置，所述第二容腔侧壁开有供所述针头组件穿过的通孔，所述第二容腔侧壁设有朝外凸出的承托腔，所述第一针头的头部穿过所述通孔位于所述第二容腔中，所述第一针头的尾部通过所述承托腔固设于所述第二容腔侧壁上。

上述结构中，针头组件只有其头部位于第二容腔中，而其他部分通过固设于第二容腔侧壁的承托腔中被安装在第二容腔之外，增大了第二容腔中的可操作空间，提高了操作灵活性，如固定支架、连接针头组件与支架的操作等。

作为本发明的进一步设置，所述第二容腔相对的两个侧壁分别设有外循环进口和外循环出口，所述外循环进口和外循环出口分别与所述灌注装置连接形成单向流通的外部液体循环机构。

上述结构中，该外部液体循环机构是指位于三维支架外部，而位于第二容腔内的液体循环机构，该循环是单向流通的位于三维支架外部的一个循环机构，该外部液体循环机构可以减少细胞粘附于第二容腔内壁或底面上的情况，使粘附于其上的细胞尽量通过该外部液体循环被带入到三维支架中，让细胞在三维支架中培养；内外循环配合使用，效果更佳；此外，还可以通过控制灌注装置进行间隔的培养液循环，使三维支架内的细胞能更易贴于三维支架内而不会被冲走。

作为本发明的进一步设置，所述第二容腔与所述第一容腔连接的一端的两个侧壁开设有卡槽，所述透析膜组件嵌设于卡槽中，所述透析膜组件包括第一夹板、第二夹板、以及贴设于第一夹板与第二夹板之间的纤维素半透膜。

上述结构中，第一容腔和第二容腔之间设有长方形的连通通道，该连通通道的两边侧壁于其竖直方向分别开设有对应的卡槽，该透析膜组件通过卡槽嵌设于该连通通道中起到隔离第一容腔和第二容腔的作用，安装方便，同时便于更换；上述第一夹板和第二夹板为带通槽结构的夹板设置，半透膜夹设于两个夹板之间且位于通槽中，该结构设置的密封效果好且透析隔离作用好。

作为本发明的进一步设置，所述第二容腔中朝向所述透析膜组件的一端嵌设有阻断所述第一容腔与第二容腔连通的隔片。

上述结构中，该隔片能完全的隔绝两个容腔，方便两个容腔的独立换液。

作为本发明的进一步设置，所述生物反应器还包括去气泡装置，所述其气泡装置包括储液管，储液管的下端与所述灌注装置连接，储液管的上端连接有负压吸引装置，储液管的侧壁设有与所述第二容腔连通的引流口。

上述结构中，去气泡装置中的负压吸引装置可以采用去掉针头的注射器，负压吸引装置可以将第二容腔中有产生的气泡去除，确保进入第二容腔中的液体没有气泡，确保三维支架内的管脉系统不会被气泡阻塞。

作为本发明的进一步设置，所述第二容腔的底面积为第一容腔的1/3，所述第二容腔高度为所述第一容腔高度的一半。

上述结构中，第二容腔的垂直高度仅为第一容腔的一半；上述第二容腔的上方还设有突起的窗口，窗口上罩设有透明盖体；本发明通过减少垂直高度及第二容腔窗口的开口设计，极大地方便了第二容腔内与三维支架相关的操作和三维支架细胞培养过程中通过体视显微镜观察三维支架内的细胞生长状况，因为较小的高度度可以满足体视显微镜对观察距离必须很近的要求。

作为本发明的进一步设置，上述生物反应器为透明材质制成。两个容腔的透明设计，方便了底部的光线照入要求，同时也方便了荧光实时成像观察。

采用上述方案，本发明通过双腔三维灌注生物反应器系统可以让细胞在系统内获得良好的养分和气体交换，废物能得到很好的排出，细胞在普通营养培养液和诱导培养因子的作用下可以更好的生长增殖和分化成为目的细胞；而生物反应器的双腔结构设计可以使得两个容腔内的普通营养培养液和诱导培养因子独立换液，在更换普通营养培养液的同时可以保留诱导培养因子，大大减少诱导细胞因子的用量，提高其有效利用率，降低成本。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

附图说明

附图1为本发明具体实施例结构示意图；

附图2为本发明具体实施例结构主视图；

附图3为本发明具体实施例附图2的A-A剖视图；

附图4为本发明具体实施例的生物反应器的结构剖视图；

附图5为本发明具体实施例结构右视图；

附图6为本发明具体实施例结构左视图；

附图7为本发明具体实施例透析膜组件的结构剖视图；

附图8本发明具体实施例针头组件的结构示意图；

附图9为本发明具体实施例附图4中的连通通道的内部结构示意图；

附图10为本发明具体实施例附图4中的连通通道的另一种内部结构示意图。

具体实施方式

本发明的具体实施例如图1-9所示是双腔三维灌注生物反应器系统，包括生物反应器1，生物反应器1中设有三维支架2，生物反应器1连接有灌注装置，生物反应器包括底座 3、供普通营养培养液填充的第一容腔11，以及供诱导培养因子填充的第二容腔12，第一容腔11和第二容腔12位于底座3上，底座3起到承托及固定循环灌注装置的动力来源的蠕动泵的作用；第一容腔11和第二容腔12之间设有可供分子量小于诱导培养因子中诱导细胞因子的成分通过的透析膜组件4，三维支架2位于第二容腔12中。双腔结构的设计使得普通营养培养液和诱导培养因子被分置于两个腔中，并通过双腔之间的透析膜组件4使得细胞生长增殖所需的养分可以在两腔中随时交换，而诱导培养因子中的诱导细胞因子等大分子物质则被隔离在第二容腔12中；当更换普通营养培养液时可以保留诱导培养因子，大大减少了诱导细胞因子的用量，提高了其有效利用率，大大降低了培养成本。

上述三维支架2中设有人工或天然的三维微孔或微管道，微孔或微管道汇合形成两条进出管道分别为动脉进液管和静脉出液管，动脉进液管和静脉出液管分别与灌注装置连接形成三维支架4的内部液体循环机构。上述三维支架2的选择范围很广，可以是各种组织器官如肝脏、肺脏、心脏、肾脏的去细胞化支架，去细胞支架是通过去除器官及组织内的原有细胞，保留细胞外基质骨架形成的三维支架2。这种三维支架2具有内部的血管管道等符合正常生理的结构，通过连入上述的内部液体循环机构部分，就可以模拟体内的细胞生长三维环境，达到促进干细胞的生长和分化作用。也可以选择一些较厚的人工合成支架，只要具备上述类似血液循环的进出的循环通路，均可应用，同样器官3D打印支架也可应用。

上述结构中，在三维支架2中形成一个类似人体血管流通的内部液体循环机构，可以将三维支架2充满形成一个饱满的三维结构，使得细胞可以更好地附着于三维支架2上，使三维支架2内部各个角落的细胞得到很好的气体和代谢物质交换，在使用器官去细胞化支架及一些具有良好生物相容性的人工支架时，在细胞培养后期可以形成形状合适的组织和器官，并可通过动静脉进出液管直移植到体内对应血管上；上述动脉进液管和静脉出液管是指类似于人体血管中的液体由动脉流进，静脉流出的血液循环的管道设置。

上述灌注装置包括蠕动泵51和泵管52，上述生物反应器1的底座3上设有对应的蠕动泵卡座和与泵管52配合的管口卡座，将蠕动泵51安装于底座3上，形成一个整体，配合紧凑，减少占地空间。

如图3、8所示，上述内部液体循环机构包括分别与动脉进液管以及与静脉出液管连接的针头组件6，针头组件6相对与动脉进液管或静脉出液管连接的另一端与泵管52连接，针头组件6包括两根针头，分别为第一针头61和第二针头62，第一针头61的尾部通过硅胶头63与第二针头62的头部首尾串联连接。针头组件6通过两根针头连接，两根针头之间的硅胶头63具有一定的弹性使得该第一针头61与动脉进液管连接的一端具有更好的摆动性，便于安装三维支架2及与针头组件6的安装；另外该硅胶头63的设置可以起到防气泡进入第二容腔12的作用，当将该硅胶头63充满液体后，两个针头之间连接的密封性良好，而当第二针头62与灌注装置的连接断开之后，如果没有硅胶头63的设置，空气中的气体会随之进入第二容腔12中，严重时，会堵塞三维支架2内的管脉系统，影响细胞的培养。

上述第二容腔12侧壁开有供两个针头组件6穿过的两个通孔，第二容腔12侧壁设有朝外凸出的承托腔121，该承托腔121由托架围绕而成，第一针头61的头部穿过通孔位于第二容腔12中，第一针头61的尾部通过承托腔121固设于第二容腔12侧壁上。针头组件6只有其头部位于第二容腔12中，而其他部分通过固设于第二容腔12侧壁的承托腔121被安装在第二容腔12之外，增大了第二容腔12中的可操作空间，提高了操作灵活性，如固定三维支架2、连接针头组件6与三维支架2的操作等。

上述第二容腔12相对的两个侧壁分别设有与外循环进口和外循环出口连接的接口13，外循环进口的接口13和外循环出口的接口13分别与灌注装置连接形成单向流通的外部液体循环机构。该外部液体循环机构是指位于三维支架2外部，而位于第二容腔12内的液体循环机构，该循环是单向流通的贯通三维支架2外部的一个循环机构，该外部液体循环机构可以减少细胞粘附于第二容腔12内壁或底面上的情况，使粘附于其上的细胞尽量通过该外部液体循环被带入到三维支架2中，让细胞在三维支架2中培养；内外循环配合使用，效果更佳；此外，还可以通过控制灌注装置进行间隔的循环，使三维支架2内的细胞能更易贴于三维支架2内而不会被冲走。

如图3、4、9所示，上述第二容腔12与第一容腔11之间设有长方形的连通通道14，该连通通道14的两边侧壁于其竖直方向分别开设有对应的卡槽141，透析膜组件4嵌设于卡槽141中，透析膜组件4包括第一夹板41、第二夹板42、以及贴设于第一夹板41与第二夹板42之间的纤维素半透膜43，一般诱导细胞因子都为大分子蛋白质，故该半透膜43一般小于3.5kd，具体实验中可以根据诱导培养因子中的不同诱导细胞因子蛋白分子量的大小来设置。该透析膜组件4通过卡槽141嵌设于连通通道14中，安装方便，同时便于更换；上述第一夹板41和第二夹板42为带通槽44结构的夹板设置，半透膜43夹设于两个夹板之间且位于通槽44中，该结构设置的密封效果好且透析隔离作用好。

如图4所示，上述第二容腔12中朝向透析膜组件4的一端嵌设有阻断第一容腔11与第二容腔12连通的隔片7。该隔片7能完全的隔绝两个容腔，方便两个容腔的独立换液。上述连通通道14侧壁还设有供该隔片7插入的凹槽142，该凹槽142位于上述卡槽141朝向第二凹腔12的一端且隔片7与透析膜组件4之间留有空隙，两者为独立安装于连通通道14中如图10所示。独立安装的透析膜组件4和隔板7具有更好的密封性能。

如图1所示，上述生物反应器1还包括去气泡装置8，其气泡装置8包括储液管81，储液管81的下端与通过医用三通管与泵管52连接，储液管81的上端连接有负压吸引装置82，储液管81的侧壁设有与三维支架2上的动脉进液管连接的针头组件6连通的引流口811。 去气泡装置8中的负压吸引装置82可以采用去掉针头的注射器，负压吸引装置82可以将第二容腔12中有产生的气泡去除，确保进入第二容腔12中的液体没有气泡，确保三维支架2内的管脉系统不会被气泡阻塞。

上述第二容腔12的底面积为第一容腔11的1/3，第二容腔12高度为第一容腔11高度的一半。第二容腔12的垂直高度仅为第一容腔11的一半；上述第二容腔12的上方还设有突起的窗口122，窗口122上罩设有透明盖体123；本发明通过减少第二容腔12的垂直高度，以及第二容腔12的窗口13设计，极大地方便了第二容腔12内与三维支架2相关的操作和三维支架2细胞培养过程中通过体视显微镜观察三维支架内的细胞生长状况，因为较小的高度度可以满足体视显微镜对观察距离必须很近的要求。

如图3所示，上述第一容腔11相对与第二容腔12连接的另一端设有连接管111，该连接管111上套设有密封圈114，连接管111上螺纹连接有接口盖112，接口盖112上开设有与灌注装置连接的标准接口113。本发明中涉及到与灌注装置连接的接口或管道均为标准件设置，便于配置。第一容腔11通过可开启式的连接管111设计，使得腔体内的液体轻易地注入或移除，另外，还降低了培养过程中的细菌污染的可能性。该设计不仅可以进液体也可以进气体，通过鼓泡式气体结合发，能很好的避免培养装置细胞被鼓泡装置产生的气泡损伤。

上述生物反应器1为透明材质制成，根据不同生产条件可由光学透明的聚苯乙烯和其他聚乙烯类塑料材质制成。两个容腔的透明设计，方便了底部的光线照入要求，同时也方便了荧光实时成像观察。

采用上述方案，本发明通过双腔三维灌注生物反应器系统可以让细胞在系统内获得良好的养分和气体交换，废物能得到很好的排出，细胞在普通营养培养液和诱导培养因子的作用下可以更好的生长增殖和分化成为目的细胞；而生物反应器1的双腔结构设计可以使得两个容腔内的普通营养培养液和诱导培养因子独立换液，在更换普通营养培养液的同时可以保留诱导培养因子，大大减少诱导细胞因子的用量，提高其有效利用率，降低成本。

Claims (10)

1.一种双腔三维灌注生物反应器系统，包括生物反应器，生物反应器中设有三维支架，生物反应器连接有灌注装置，其特征在于：所述生物反应器包括供普通营养培养液填充的第一容腔，以及供诱导培养因子填充的第二容腔，第一容腔和第二容腔之间设有可供分子量小于诱导培养因子中诱导细胞因子的成分通过的透析膜组件，所述三维支架位于所述第二容腔中。

2.根据权利要求1所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述三维支架中设有微孔或微管道，所述微孔或微管道汇合形成两条进出管道分别为动脉进液管和静脉出液管，所述动脉进液管和静脉出液管分别与所述灌注装置连接形成三维支架的内部液体循环机构。

3.根据权利要求2所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述内部液体循环机构包括分别与所述动脉进液管以及与所述静脉出液管连接的针头组件，所述针头组件相对与所述动脉进液管或静脉出液管连接的另一端与所述灌注装置连接，所述针头组件包括至少两根针头，分别为第一针头和第二针头，第一针头的尾部通过硅胶头与所述第二针头的头部首尾串联连接。

4.根据权利要求3所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述第二容腔侧壁开有供所述针头组件穿过的通孔，所述第二容腔侧壁设有朝外凸出的承托腔，所述第一针头的头部穿过所述通孔位于所述第二容腔中，所述第一针头的尾部通过所述承托腔固设于所述第二容腔侧壁上。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述第二容腔相对的两个侧壁分别设有外循环进口和外循环出口，所述外循环进口和外循环出口分别与所述灌注装置连接形成单向流通的外部液体循环机构。

6.根据权利要求1所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述第二容腔与所述第一容腔连接的一端的两个侧壁开设有卡槽，所述透析膜组件嵌设于卡槽中，所述透析膜组件包括第一夹板、第二夹板、以及贴设于第一夹板与第二夹板之间的纤维素半透膜。

7.根据权利要求1或6所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述第二容腔中朝向所述透析膜组件的一端嵌设有阻断所述第一容腔与第二容腔连通的隔片。

8.根据权利要求1所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器还包括去气泡装置，所述其气泡装置包括储液管，储液管的下端与所述灌注装置连接，储液管的上端连接有负压吸引装置，储液管的侧壁设有与所述第二容腔连通的引流口。

9.根据权利要求1所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述第二容腔的底面积为第一容腔的1/3，所述第二容腔高度为所述第一容腔高度的一半。

10.根据权利要求1所述的双腔三维灌注生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器为透明材质制成。