Микроскопы для генетики и цитогенетики
Цитогенетическое исследование — это анализ хромосом, исследуемых под микроскопом, результаты которого необходимы для постановки диагноза, классификации, лечения и научного исследования заболеваний системы крови, прежде всего — онкогематологических.
Морфология хромосом сильно варьируется во время клеточного цикла, в связи с чем наилучшей стадией для микроскопического анализа хромосомы является стадия прометафазы метоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды. Особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.
Клетки человека в норме содержат 23 пары хромосом, одна пара из которых является половой: две Х-хромосомы у женщин и по одной копии хромосом (X и Y) у мужчин.
Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения — фитогемагглютинином.
Окрашивание хромосом в гематологии.
В конце 1960-х годов была разработана методология дифференциального окрашивания метафазных хромосом, а в 1971 г. создана номенклатура хромосомных сегментов, позволяющая точно описывать хромосомные аномалии. Позднее были внедрены методики окрашивания менее конденсированных и, соответственно, более длинных профазных и прометафазных хромосом, которые обладают более высоким разрешением, так как позволяют визуализацию 500-2000 сегментов (метафазное окрашивание визуализирует только 300 сегментов).
В настоящее время существуют несколько видов дифференциального окрашивания хромосом:
- Q-banding - окрашивание акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом;
- G-banding - окрашивание по Гимзе;
- R-banding - обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе.
Помимо Q-, G- и R-окрашивания, позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание).
В 1980-х годах появился новый метод, называемый флюоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).
Если зонд синтезирован с включением флюоресцентных или антигенных молекул, которые распознаются флюоресцирующими антителами, становится возможной визуализация относительного положения зонда на анализируемой ДНК.
Метод FISH предназначен для выявления:
- гибридных клеток;
- транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий;
- меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.
В настоящее время возможно выполнение многоцветной гибридизации in situ для одновременного окрашивания всех хромосом в сложном кариотипе с множественными числовыми и структурными аномалиями. Комбинация разных модифицирующих агентов и флюорохромных красителей позволяет одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК в одном ядре (флюоресцеин дает зеленую флюоресценцию, техасский красный и родамин — красную, гидроксикумарин — голубую и т. д.). Сочетание пяти флюорохромов в разных пропорциях и компьютерный анализ изображений позволяет одновременно окрасить разным цветом все хромосомы и визуализировать 27 различных ДНК-зондов, которые служат уникальной меткой для каждой хромосомы. Эта методика называется многоцветной FISH. (M-FISH).
Для цитогенетических исследований необходим прямой микроскоп со светлым полем и флуоресценцией с различными флуоресцентными кубами. Также будет важным наличие камеры со специализированным программным обеспечением (ПО), позволяющим производить обработку
Цитогенетическое исследование — это анализ хромосом, исследуемых под микроскопом, результаты которого необходимы для постановки диагноза, классификации, лечения и научного исследования заболеваний системы крови, прежде всего — онкогематологических.
Морфология хромосом сильно варьируется во время клеточного цикла, в связи с чем наилучшей стадией для микроскопического анализа хромосомы является стадия прометафазы метоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды. Особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.
Клетки человека в норме содержат 23 пары хромосом, одна пара из которых является половой: две Х-хромосомы у женщин и по одной копии хромосом (X и Y) у мужчин.
Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения — фитогемагглютинином.
Окрашивание хромосом в гематологии.
В конце 1960-х годов была разработана методология дифференциального окрашивания метафазных хромосом, а в 1971 г. создана номенклатура хромосомных сегментов, позволяющая точно описывать хромосомные аномалии. Позднее были внедрены методики окрашивания менее конденсированных и, соответственно, более длинных профазных и прометафазных хромосом, которые обладают более высоким разрешением, так как позволяют визуализацию 500-2000 сегментов (метафазное окрашивание визуализирует только 300 сегментов).
В настоящее время существуют несколько видов дифференциального окрашивания хромосом:
- Q-banding - окрашивание акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом;
- G-banding - окрашивание по Гимзе;
- R-banding - обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе.
Помимо Q-, G- и R-окрашивания, позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание).
В 1980-х годах появился новый метод, называемый флюоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).
Если зонд синтезирован с включением флюоресцентных или антигенных молекул, которые распознаются флюоресцирующими антителами, становится возможной визуализация относительного положения зонда на анализируемой ДНК.
Метод FISH предназначен для выявления:
- гибридных клеток;
- транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий;
- меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.
В настоящее время возможно выполнение многоцветной гибридизации in situ для одновременного окрашивания всех хромосом в сложном кариотипе с множественными числовыми и структурными аномалиями. Комбинация разных модифицирующих агентов и флюорохромных красителей позволяет одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК в одном ядре (флюоресцеин дает зеленую флюоресценцию, техасский красный и родамин — красную, гидроксикумарин — голубую и т. д.). Сочетание пяти флюорохромов в разных пропорциях и компьютерный анализ изображений позволяет одновременно окрасить разным цветом все хромосомы и визуализировать 27 различных ДНК-зондов, которые служат уникальной меткой для каждой хромосомы. Эта методика называется многоцветной FISH. (M-FISH).
Для цитогенетических исследований необходим прямой микроскоп со светлым полем и флуоресценцией с различными флуоресцентными кубами. Также будет важным наличие камеры со специализированным программным обеспечением (ПО), позволяющим производить обработку
и измерение полученных объектов на изображении.
